程：  傳真  

 河豚毒素（TTX）定量酶聯免疫檢測試劑盒說明

本測試盒用間接競爭免疫分析法定量測定河豚魚中的河豚毒素（TTX）。該測試盒反應孔可拆卸，可測單份樣品，也可測多份樣品。定量分析時需有含450nm波長的微孔板酶標儀。

1 概要

河豚毒素（TTX）是一種強神經毒素，其性質穩定，加熱、鹽腌及高溫烹煮均不易使其被破壞。河豚魚中常含有河豚毒素。我國沿海居民素有食用河豚魚的習慣。因誤食或食用加工不當的河豚魚而發生人畜中毒的事件每年都有發生。故準確檢測河豚魚中的河豚毒素對預防和控制河豚毒素中毒，具有重要意義。本檢測方法具有靈敏、快速、簡便、特異性好、取樣量小并可同時檢測大量樣品等優點。

2 測定原理

本試劑盒采用固相酶聯免疫吸附原理，利用間接競爭ELISA法進行測定。用抗原包被微孔板，加入河豚毒素標準品或樣品、抗河豚毒素單克隆抗體進行孵育后，將未與包被抗原結合的抗體洗去；再加入酶標記的抗鼠IgG抗體孵育，加入顯色液，經過終止液終止后，用酶標儀在450nm處測定OD值。

3 提供的物品

微孔板

5個濃度的TTX標準溶液（各0.5mL）

標準1：0ng/mL   ……………………………………………直接使用

標準2：10.0ng/mL      ………………………………………直接使用

標準3：20.0ng/mL      ………………………………………直接使用

標準4：50.0ng/mL      ………………………………………直接使用

標準5：200.0ng/mL    ………………………………………直接使用

抗體溶液（6mL）     ………………………………………………直接使用

酶標物（12mL）       ………………………………………………直接使用

顯色液（12mL）       ………………………………………………直接使用

終止液（6mL） ………………………………………………………直接使用

濃縮洗液（30mL）   …………………………………………………稀釋使用

4 盒中未提供，需自備物品

微孔板酶標儀（含450nm）、離心機、電爐、微量移液器、磁力攪拌器

量筒、漏斗、容量瓶、快速定性濾紙、分液漏斗

乙 酸、氫氧化鈉、去離子水或蒸餾水、PBS緩沖液

5 操作者注意事項

        標準溶液中含有TTX毒素，應特別小心。

終止液為0.5M硫 酸，避免接觸皮膚。

每次加樣后立即將所有試劑放回2~8 ℃。

每步加樣時間應控制在5min內。

孵育過程中應避光。

不要使用過期試劑盒。

        不要交叉使用不同批號試劑盒中的試劑。

6 儲存條件

        保存試劑盒于2~8℃。不要冷凍

        顯色液對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

        將不用的微孔板放進原鋁箔袋中，置2~8℃保存。

7 試劑變質的標志

        標準1的吸光度值小于0.5個單位（A_450nm<0.5）時，表示試劑可能變質。

8 樣品處理

8.1 鮮河豚魚中河豚毒素的檢測

----稱取5g河豚魚樣品（肌肉、皮或內臟），剪碎，加入25mL 0.1%的乙 酸，用燒杯在電爐上煮沸攪拌10min。此步驟應注意不要讓液體沸出容器，應控制加熱溫度，并不斷攪拌。

----待冷卻至室溫后，上清用快速定性濾紙過濾于50mL離心管中

----沉淀用20mL0.1% 乙 酸洗到燒杯中，再煮沸3min

----冷卻至室溫后，所有的液體及煮沸的樣品都加到離心管中，3000rpm離心10min。

----取上清，量體積，置分液漏斗中

----加入等體積乙迷，振搖1分鐘，靜置分層。放出水層，量體積后至另一分液漏斗中，再加入等體積的乙迷，振搖1分鐘，靜止分層。

----將水層放入50mL容量瓶中，用1M氫氧化鈉調節提取液中的pH值至6.5~7.4，然后加入PBS至50mL，提取液4℃保存備用。

8.2 魚片、魚干制品中河豚毒素的檢測

-----樣品中的TTX用0.1%乙 酸在水浴中超聲提取，提取液中的TTX用ELISA方法進行檢測，若樣品中TTX含量低于檢出限則報告為<100mg/kg；樣品中TTX含量在100~3000mg/kg之間，直接按ELISA實驗結果報告；如果樣品中TTX含量達到3000mg/kg，則需采用小鼠生物測定法進行驗證，確認毒性反應后再按照ELISA實驗結果報告。 

9 酶免疫分析程序

----濃縮洗液為10倍濃縮液，使用時與去離子水或蒸餾水按體積比1:9稀釋后使用。

----取所需數量的板條插入微孔架，用洗液洗滌微孔板3min×2次，記錄樣品及標準的位置。

        ----加入50mL標準品或處理好的樣品到微孔，每個標準和樣品必須使用新的吸頭。

----加入50mL抗河豚毒素單克隆抗體溶液到每個微孔（注意移液器管尖不要接觸到孔中的液體，避免交叉污染）中，37℃孵育90min。

----甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板3min×3次，zui后一次應在吸水紙上拍打以*除去孔中液體。

    ----每孔加入酶標物100mL，37℃孵育60min。

    ----用洗液洗滌微孔板3min×5次，zui后一次應在吸水紙上拍打以*除去孔中液體。

    ----每孔加入顯色液100mL（2滴），37℃孵育12min。

----每孔加入終止液50mL（1滴），立即用酶標儀在波長450nm處測定吸光度值（OD值）。

注：在定量分析中，顯色液和終止液需要用移液器準確量取。

10 樣品濃度計算

以標準溶液OD值與標準1的OD值的比值為縱坐標（即標準品OD比），所對應標準溶液濃度（ng/mL）的對數值為橫坐標，制作標準曲線。根據樣品OD值與標準1的OD的比值（即樣品OD比），可從曲線上得到對應點的橫坐標，即為TTX濃度的對數值，求得反對數即為測定液中TTX濃度C（ng/mL），按下列公式計算出樣品中TTX含量：

TTX含量（mg/kg）= 10×C×K

式中：C：測定液中TTX濃度（ng/mL）

            K：提取液的稀釋倍數

11 主要技術指標及參數

11.1  zui低檢出濃度10.0 ng/mL。

11.2  加標回收率在70~120%，條內變異系數＜10%，條件變異系數＜15%。

附圖（僅供參考）